Pablo Pizzani*, Eduardo Barón*, Irana Matute** Giovanna De Martino*, Luis Ojeda***, Nirza Noguera***
Universidad Rómulo Gallegos, Área Agronomía, San Juan de Los Morros, Guárico-Venezuela. **Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA), Laboratorio de Nutrición Animal, Aragua-Venezuela. ***Sección de Biotecnología Agroindustrial, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Francisco Javier Triana Alonso” de la Universidad de Carabobo, Aragua-Venezuela. Correo de correspondencia: pablopizzanic@gmail.com
RESUMEN
En Venezuela la producción ganadera se sustenta en sistemas silvopastoriles. De acuerdo a la diversidad y complejidad de especies vegetales, la ganancia de peso y el rendimiento se pueden ver afectados por la presencia de factores anti nutricionales en las plantas. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la composición fitoquímica y nutricional de estructuras vegetativas y reproductivas de Gliricidia sepium, en diferentes estados de maduración. Para esto, se tomaron muestras de biomasa joven (BJ), biomasa madura (BM), frutos verdes de biomasa joven (FVBJ), frutos verdes biomasa madura (FVBM), frutos maduros biomasa joven (FMBJ) y frutos maduros biomasa madura (FMBM), a los cuales se realizó análisis bromatológico y mineral, además de tamizaje fitoquímico. Los resultados demostraron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre las distintas estructuras en los estados de maduración evaluados. Dentro de los hallazgos más relevantes destacan que, los porcentajes más elevados de inhibidores de tripsina (Inht) lo exhibieron las muestras de FMBJ (58,56%) y FVBJ (57,32%); el 100% de las muestras se encontraron fenoles totales (FT), flavonoides (Flav), catequinas (Catq), taninos que precipitan las proteínas (TPP), triterpenos (Trip), esteroides (Est), saponinas (Sap) y azúcares reductores (Azr). Sólo en las muestras de BJ se determinó la presencia de alcaloides (Alc), y en las muestras de frutos (FVBJ, FVBM, FMBJ y FMBM) la de aminoácidos no proteicos (AANP), con mayor reacción en los frutos verdes y maduros de biomasa joven. Los resultados demuestran que el estado de maduración incide en la composición de G. sepium y es un factor que se debe considerar para efectos de la digestibilidad.
INTRODUCCIÓN
Los sistemas silvopastoriles o sistemas agroforestales pecuarios, se caracterizan por combinar pastos tropicales seleccionados con arbustos forrajeros y especies de árboles maderables o frutales para el ramoneo directo del ganado (Montagnini y cols., 2015; Costa y cols, 2020). Con esta combinación se incrementa la oferta de proteínas y minerales disponibles para el ganado (Ku-Vera y cols., 2013). Entre las especies arbóreas más frecuentes usadas para este fin destacan Acacia pennatula (Schltdl. & Cham) Benth., Enterolobium cyclocarpum (Jacq.) Griseb., Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit, Guazuma ulmifolia Lam., Gliricidia sepium (Jacq.) Kunth ex Walp., los cuales poseen un contenido de proteína cruda (PC) superior (Canul-Solí y cols., 2018). Sin embargo, muchas de estas especies presentan metabolitos secundarios, tales como taninos, saponinas, compuestos fenólicos y alcaloides, que cumplen una función de defensa para las plantas contra factores externos como hongo, bacterias, virus y la luz ultravioleta, pero que pueden tener un efecto negativo sobre la palatabilidad y digestibilidad en los animales, encareciendo su valor nutricional.
En Venezuela, una de las plantas forrajeras que se encuentra en la mayoría de los sistemas agropecuarios es la Gliricidia sepium (Jacq.) Kunth ex Walp, conocida coloquialmente como “Mataratón”. Se encuentra extendida en todo el territorio nacional y representa un sustrato con gran potencial en la alimentación animal, debido a su excelente rendimiento en materia seca y alto valor nutritivo por su contenido proteico y de minerales (Canul-Solís y cols., 2018; Miranda y cols., 2021). En este sentido, un estudio realizado por Zambrano y cols. (2017) en Ecuador, en el que evaluaron la producción de leche en vacas Gyrolando suplementadas con matarratón (G. sepium) y caña de azúcar (Saccharum officinarum), demostró el aporte nutritivo de esta especie. Los investigadores obtuvieron que el tratamiento a base de pastoreo, 75 % de matarratón y 25 % de caña de azúcar alcanzó el pico máximo de producción de leche diaria y semanal (9,88 kg/vaca/día y 174 kg/vaca/día). También calcularon que la mejor relación costo beneficio se registró con el tratamiento a pastoreo y suplemento de 100 % de matarratón con 0,88 USD. Los investigadores concluyeron que la suplementación con ambas especies vegetales mejora el rendimiento económico de los pequeños y medianos productores de leche para vacas mestizas Gyrolando.
Adicionalmente, estudios recientes han demostrado que, posee la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico al suelo con facilidad, lo que mejora el contenido proteico de otras especies vegetales que estén en asociación con esta planta. Tal como es el caso de la investigación realizada por Kaba y cols.,(2019), en la que estimaron la fijación de nitrógeno atmosférico de G. sepium en beneficio de árboles de cacao (Theobroma cacao) en sistemas agroforestales. Encontraron que, en la mayoría de los casos, las hojas de matarratón y los árboles de cacao que crecían próximos tenían un contenido similar de nitrógeno. A nivel de la raíz de matarratón durante la estación húmeda, encontraron nódulos de color rojo interno, lo que indica una fijación efectiva de N2 y la presencia de Rhizobium tropici y Rhizobium etli. Concluyeron que la capacidad de simbiosis de G. sepium con especies de Rhizobium pueden satisfacer, al menos en parte, las necesidades de N en los sistemas agroforestales mixtos, reduciendo la necesidad de fertilización adicional. Esto puede también mejorar la calidad de los pastos y de otras especies que estén en asociación.
Por otra parte, otros estudios advierten sobre la presencia de metabolitos secundarios en esta planta, que pueden actuar como potenciales factores antinutricionales. Norton (1994) determinó la presencia de taninos condensados, cumarinas, ácido cumárico, glucósidos cianogénicos y nitratos en el follaje de G. sepium, así como canavanina en las semillas. Dichos metabolitos han sido relacionados con la capacidad de esta planta de envenenar ratones (Skerman y cols.,1991; Bennison y Paterson, 1993) y también se han usado experimentalmente contra insectos plaga de cultivos como Spodoptera frugiperda (González-López y cols.,2017). Sin embargo, este efecto antinutricional no ha sido demostrado con certeza en rumiantes. Es por ello, que el objetivo del presente trabajo fue caracterizar la composición fitoquímica y bromatológica de estructuras vegetativas y frutos de la especie G. sepium, en diferentes estados de maduración y analizar como esto puede incidir en la nutrición de los animales.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación de la colecta
La recolección de las muestras se llevó a cabo en la Estación Experimental y de Producción Agrícola “Rafael Rangel” (EEPARR) perteneciente a la Universidad de los Andes, municipio Pampán del Estado Trujillo, Venezuela. La EEPARR se encuentra situada entre los paralelos 09º35’00” y 09º37’19” de Latitud Norte y entre los meridianos 70º27’00” y 70º31’39” de Longitud Oeste, a una altitud entre 270 y 300 msnm.
Condiciones edafoclimáticas
La zona presenta un relieve llano, microrelieve liso con una pendiente oeste-este aproximadamente de 1% a 220 msnm. El suelo presenta una profundidad efectiva de 50 cm y un drenaje restringido con permeabilidad moderada a lenta (Matheus y cols.., 2007). La deposición geomorfológica corresponde principalmente a napas franco-arenosas de desbordamientos y que descansan posiblemente sobre la formación geológica Mucuchachí.
La temperatura mínima en la zona es de 24 ºC y la máxima de 38 ºC, la media anual es de 28 ºC. La precipitación oscila entre 800 a 1200 mm/año. La lluvia presenta dos ciclos; el 70% del total se acumula entre abril-julio y el resto en octubre-noviembre.
El suelo donde se desarrolló el ensayo es del Orden Inceptisol, suborden: Ochrepts, gran grupo: Ustochrepts, Subgrupo: Fluventic.
Procedimiento de muestreo
El material vegetal fue clasificado de acuerdo a la estructura de la planta y el estado de maduración. Las hojas y peciolos conformaron la biomasa (B), y los frutos (F). Se consideró joven el material fresco con turgencia por su elevado contenido de humedad y su color verde característico, y maduro al material con menor contenido de humedad, más lignificado. Las muestras se clasificaron en: biomasa joven (BJ), biomasa madura (BM), frutos verdes de biomasa joven (FVBJ), frutos verdes biomasa madura (FVBM), frutos maduros biomasa joven (FMBJ) y frutos maduros biomasa madura (FMBM).
Se escogieron tres áreas de muestreo, en cada una se seleccionaron tres plantas al azar, y se tomaron tres fracciones de biomasa y frutos en diferentes estratos (apical, media y basal). El muestreo en cada área se realizó en espiral, considerando cuadrantes de los cuatro puntos cardinales para evitar la influencia de la intensidad lumínica en la presencia y niveles de metabolitos secundario.
La cantidad de muestra colectada para BJ y BM fue de 680 g de hojas y pecíolos para cada una por área de muestreo. Para las muestras F, 390 g de frutos por cada área de muestreo para cada tipo (FVBJ, FVBM, FMBJ, FMBM). Las muestras fueron identificadas y trasladadas en bolsas de papel hasta el laboratorio para su procesamiento.
Preparación de las muestras
Las muestras fueron sometidas a secado por cinco días a temperatura ambiente en ausencia de luz, para evitar la foto-oxidación de los metabolitos secundarios. Posteriormente, se molieron hasta un tamaño de partícula de 1 mm y se colocaron en frascos de vidrio herméticos hasta el momento del análisis, el cual no superó los 25 días de almacenamiento.
Mediciones analíticas
Bromatología
A cada muestra se le determinó el contenido de materia seca (MS), proteína cruda (PC), fósforo (P) y ceniza mediante las metodologías propuestas por la AOAC (2005). La fracción fibrosa se cuantificó según los protocolos descritos por Van Soest y cols. (1991) y los almidones y azucares por la metodología gravimétrica Munson- Walker (1906) los carbohidratos solubles (CHS) por la técnica de la Antrona/H2SO4 con lectura a 660 nanómetros (Lezcano y González, 2000). La energía bruta se determinó en una bomba calorimétrica PARR 1261.
Análisis fitoquímico (tamizaje)
Para la detección de metabolitos secundarios mediante el análisis orgánico, se utilizó la metodología descrita por García (2003); 10 g de cada muestra se maceraron con 50 ml de etanol al 98 % durante 48 horas. A los extractos alcohólicos se le aplicó el tamizaje fitoquímico de Rondina y Cussio, descrito por Alfonso y cols., (2000), donde el extracto crudo fue fraccionado mediante la utilización de mezclas de solventes selectivos (cloroformo, HCl (1%), cloroformo: etanol (3:2), cloroformo saturado con sulfato de sodio anhidro, H2O) para la obtención de siete fracciones análogas, a las cuales se le aplicaron diferentes reacciones cualitativas para la detección de cada grupo de compuestos o Metabolitos.
Los metabolitos secundarios evaluados fenoles totales (FT), flavonoides (Flav), taninos que precipitan las proteínas (TPP), taninos condensados (TC), esteroles (Est), quinonas (Quin), cumarinas (Cum), aminoácidos no proteicos (AANP), alcaloides (Alc), saponinas (Sap), triterpenos (Trip), catequinas (catq), azúcares reductores (Azr), cardenolios (Card) y proantocianidinas (Proantc). Para expresar los resultados fitoquímicos se utilizó el sistema de cruces para especificar la presencia (+) o ausencia (-) de los metabolitos en los tratamientos (García, 2003). La concentración cualitativa de los metabolitos secundarios fue expresada de la siguiente manera: (++++) Presencia Cuantiosa; (+++) Presencia Moderada; (++) Presencia Leve; (+) Trazas, tomando en cuenta la intensidad del color y/o precipitado observado en cada una de las muestras.
La estimación cualitativa de los contenidos de Saponinas fue realizada sobre la escala establecida por Galindo y cols., (1989). Altura de la espuma ≤ 10 mm presencia baja, 11-14 mm presencia moderada, ≥ 15 mm presencia abundante.
En todos los casos se contó con un panel de tres expertos para la clasificación de cada ensayo acorde al rango de la señal analítica visual y así de esa forma proponer un resultado promedio según los criterios de cada observador. Para la cuantificación de los Inhibidores de tripsina se utilizó el análisis de actividad enzimática con patrón sintético (AOAC, 2005).
Diseño experimental y análisis estadísticos
Se utilizó un diseño totalmente aleatorizado con tres replicas. Para el procesamiento de la información se empleó el paquete estadístico SPSS versión 10.0. A los datos se le realizó ANOVA usando la prueba de media de Tukey para separar los promedios a p <0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis bromatológico
Los resultados del análisis bromatológico se muestran en el cuadro 1. El contenido de materia seca osciló alrededor del 92,00 % para todas las muestras, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellas (p > 0,05). En lo que respecta al contenido de grasa, las muestras de biomasa exhibieron valores significativamente más altos (p < 0,05), alrededor de 2,00 %, seguido de los FVBJ con 1,00 %, mientras que las demás muestras de frutos estuvieron por debajo del 0,50 %. Para el contenido de fibra se formaron cuatro grupos estadísticamente distintos, siendo las muestras de frutos verdes (FVBJ, FVBM y FMBJ), las que mostraron valores por encima del 50,00 %, seguido por FMBJ.
En cuanto al contenido de proteínas, a partir de la biomasa se obtuvieron los mayores valores, alrededor del 20 %, significativamente superiores al contenido de las muestras de frutos (p < 0,05). Valores similares de PC (24,9%) obtuvieron Aye y Adegun (2013), quienes analizaron follaje de G. sepium.
Las cenizas exhibieron un comportamiento similar al de las proteínas, puesto que las muestras de biomasa tuvieron los % más altos, ubicados en 6,60 % para BJ y 6,80 % para BM. Al comparar el valor de cenizas encontrado con el valor medio de elementos inorgánicos presentes en plantas forrajeras evaluadas por otros investigadores (McClements y Decker, 2009), se puede afirmar que es alto y concuerda con los hallazgos de Aye y Adegun (2013), quienes reportan un valor de 6,67 % para esta especie.
Cuadro 1. Composición química (%) y energética (MJ/kg) de varias muestras vegetativas y reproductivas a diferentes niveles de maduración de la planta Gliricidia sepium
Para las fracciones fibrosas (FND y FAD), los menores valores (p < 0,05), fueron registrados en las muestras de biomasa, BJ (44,10 y 25,60 %) y BM (47,20 y 28,50 %). Estos resultados coinciden con los obtenidos por García y cols. (2008), FND (42,4%) y FAD (27,98%). La diferencia en cuanto al contenido de las muestras de frutos (FVBJ, FVBM, FMBJ, FMBM), podrían estar asociados al contenido de celulosa del pericarpio.
En lo que se refiere al contenido de lignina, osciló entre 9 y 11%, sin diferencias entre las distintas muestras (p > 0,05). Comportamiento distinto para celulosa y hemicelulosa, cuyos valores más altos se obtuvieron para las muestras de frutos, FVBJ (45,70 %) y FVBM (22,00 %), respectivamente (p < 0,05). Al igual que el contenido de almidón, que estuvo alrededor de 20,00 % en las muestras de fruto (FVBJ, FVBM, FMBJ, FMBM). Este resultado fue consistente con el hecho de que la energía bruta también fue significativamente más alta en estas muestras, que en el caso de las muestras de biomasa (p < 0,05).
Los valores de fósforo (P) se expresaron en mM y los resultados más altos se encontraron con las muestras de BJ de 9,40 mM (p < 0,05). En lo que se refiere a los inhibidores de tripsina oscilaron entre 44,80 y 58,60 %, sin diferencias estadísticas entre los diferentes tipos muestras (p < 0,05). Estos resultados están muy por encima de lo reportado por García y cols., (2008), inhibición de tripsina (19,73%), esta discrepancia podría estar asociada a condiciones edafoclimáticas y a la edad de las plantas empleadas en los estudios.
Los contenidos promedios de energía bruta de los sustratos frutos y biomasas fueron de 18,29 y 17,13 Mj/kg respectivamente. Estos valores, estuvieron por debajo de los encontrados por por Aye y Adegun (2013).
Metabolitos secundarios
En el cuadro 2 se resume los resultados en cuanto a los metabolitos secundarios evaluados. Se confirma la presencia de una gran variedad de éstos, con diferentes niveles de intensidad según la estructura vegetativa y el estado de maduración. En todas las muestras se encontraron fenoles totales (FT), flavonoides (Flav), taninos condensados (TC), catequinas (Catq), taninos que precipitan proteínas (TPP), triterpenos (Trit), esteroides (Est), saponinas (Sap) y azúcares reductores (Azr). Estos resultados coinciden con el análisis fitoquímico preliminar realizado a hojas de G. sepium por Dubal y cols. (2020) usando etanol como solvente para la extracción. Estos investigadores encontraron una considerable cantidad de flavonoides, glucósidos, esteroides, taninos, carbohidratos y proteínas. Los investigadores también encontraron gran contenido de alcaloides (Alc), pero en el caso de la presente investigación este metabolito sólo se encontró en las muestras de BJ, las demás resultaron negativas.
En ninguna de las muestras se encontraron quinonas (Quin), proantocianidinas (Proant), ni cardenolios (Card). La ausencia de Quin coincide con los resultados de Renjith y cols. (2021), en extractos etanólicos de las hojas de esta planta. Sin embargo, estos autores también tuvieron respuestas negativas de alcaloides, carotenoides, flavonoides y quinonas, lo cual difiere de los hallazgos de esta investigación y de lo previamente descrito por Dubal y cols., (2020). Estas discrepancias pueden estar asociadas no sólo con características de las plantas estudiadas por su ubicación geográfica, sino también por el método de extracción empleado y la sensibilidad de las pruebas empleadas para la detección de los metabolitos.
Cuadro 2. Tamizado fitoquímico de las muestras vegetativas y reproductivas en diferentes estados de maduración de la planta. Gliricidia sepium.
BJ: Biomasa joven; BM: Biomasa madura; FVBJ: Fruto verde biomasa joven; FVBM: Fruto verde biomasa madura; FMBJ: Fruto maduro biomasa joven; FMBM: Fruto maduro biomasa madura. Quin: Quinonas; Cumar: Cumainas; Flav: Flavonoides; TC: Taninos Condensados; Proant; Proantocianidinas; Catq: Catequinas; TPP: Taninos que Precipitan Proteínas; Card: Cardenolios; Trit: Triterpenos; Est: Esteroles; Sap: Saponinas; aminoácidos no proteicos (AANP); Azuc: Azucares Reductores. La concentración cualitativa fue expresada de la siguiente manera: ++++ Presencia Cuantiosa; +++ Presencia moderada; ++ Presencia Leve; + Trazas, esto tomando en cuenta la intensidad del color y/o precipitado observado en cada una de las muestras. Sin embargo, en el caso de las Saponinas la concentración cualitativa se expresó de manera diferente: +++ Abundante (> 14 mm de espuma); ++ Moderada (10 – 14 mm de espuma); + Baja (< 10 mm de espuma).
Al comparar los resultados de las diferentes muestras evaluadas, el mayor número de reacciones positivas a la sumatoria de los metabolitos secundarios correspondieron a los frutos maduros de ambos tipos de biomasa (27 unidades para FMBJ y 26 unidades para FMBM). De hecho, los aminoácidos no proteicos (AANP), sólo se encontraron en las muestras de frutos en diferentes estados de maduración, acentuándose una mayor reacción en los frutos verdes y maduros de biomasa joven.
Esta presencia importante de los metabolitos secundarios, guarda una relación estrecha con la concentración molar de fósforo, azucares simples y el proceso de maduración de los frutos. Concentraciones bajas de fósforo pueden llegar a estimular la producción de metabolitos secundarios, ya sea por la disminución de la tasa de crecimiento que favorece el flujo de nutrientes hacia la producción de estos metabolitos (Raval y cols., 2003, Sato y cols., 1996), o por la activación de enzimas relacionadas con la biosíntesis de éstos (Ramachandra y Ravishankar, 2002).
De igual forma, la maduración de los frutos está mediada por el etileno, que es una molécula pequeña que difunde fácilmente a través de la membrana celular. En las plantas el etileno participa en fenómenos de maduración, abscisión y respuesta a patógenos. Puede inducir la producción de metabolitos secundarios en las plantas (Jeong y cols., 2006; Bae y cols., 2006). Otro compuesto primario cuya concentración inicial puede afectar el crecimiento, el consumo de nutrientes y la producción de metabolitos secundarios, es la sacarosa (Akalezi y cols., 1999), la cual actúa como principal fuente de carbono, afectando la producción de metabolitos secundarios, ya sea incrementando el contenido intracelular o la concentración final del metabolito.
Los resultados indican que los diferentes estados de maduración de los compontes vegetativos y reproductivos de Gliricidia sepium afectaron su composición química y los contenidos de los metabolitos secundarios. Este conocimiento podría ser utilizado para desarrollar estrategias de manejo que potencien la tasa de utilización de este forraje por parte de los animales rumiantes.
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