Pedro María Aso
Se entiende como parasitismo a una asociación entre dos individuos en la cual uno de ellos, el parásito, obtiene sus nutrientes a partir de su hospedero el bovino, causándole a este último un daño o enfermedad, aunque su muerte conllevaría también la desaparición del microorganismo. Dentro de este concepto, la bacteria Anaplasma marginale del orden Rickettsia y los protozoarios Babesia bovis, B. bigemina y Trypanosoma vivax representan un conjunto de microorganismos que parasitan los glóbulos rojos bovinos, los tres primeros mientras que el tripanosoma es de vida extracelular y se mantiene en el torrente sanguíneo. Estos patógenos tienen en común que, al ser transmitidos por insectos hematófagos, pueden causar en el bovino una infección aguda acompañada de una elevación de la temperatura corporal y un cuadro anémico que causa su debilitamiento y eventualmente su muerte o pasar a un estado crónico de portador en el cual ambos, el patógeno y el hospedero, coexisten generándose una respuesta inmunitaria, protectiva o no, hasta que una recidiva pudiera surgir.
Como estos cuatro hemoparásitos generan un cuadro sintomático muy similar, la mera observación de los signos y síntomas, si bien muy importante y valiosa, no permiten por si sola establecer un diagnóstico certero sobre quién es el agente causal del cuadro observado. Es por ello que la observación clínica debe necesariamente acompañarse de la información epidemiológica disponible y del diagnóstico del laboratorio, de modo que se conjuguen estas experticias para decidir el tratamiento apropiado en beneficio del animal, del rebaño y del control de las pérdidas causadas por estos patógenos.
En Venezuela distintos grupos de investigación han adaptado, desarrollado y utilizado los tres tipos de diagnósticos de laboratorio mundialmente aceptados para identificar al o los hemoparásitos que puedan estar infectando a un animal: el parasitológico, el inmunológico y el molecular. En nuestra experiencia, cada salida de trabajo de campo se organiza de tal manera para hacer la toma de muestras de sangre del rebaño, que permitan realizar estos tres ensayos de laboratorio y así obtener un cuadro epizoótico por hemoparásitos más completo de los lugares visitados.
Diagnóstico parasitológico
Consiste en la identificación visual de los hemoparásitos en sangre periférica tomada en presencia de edetato (etilendiamina tetra acetato disódico, EDTA) como anticoagulante. Los extendidos o frotis sanguíneos delgados, una vez secos, se fijan y se tiñen con el clásico colorante de Giemsa o con versiones comerciales como Hemacolor® que permite teñir los extendidos en minutos para ser observados al microscopio (Figura 1).
Figura 1. [a] Microfotografías de Anaplasma marginale,[b] Trypanosoma vivax, [c] Babesia bovis en fotos de sangre coloreados
Dentro del diagnóstico parasitológico para la identificación de A. marginale podemos hacer la coloración con naranja de acridina que requiere el uso del microscopio fluorescente para la visualización de la rickettsia y el método del microhematocrito (Woo, 1969) para visualizar los tripanosomas en la fase de la capa blanca al microscopio (Figura 2).
Con este mismo capilar se determina también el volumen de la fracción de eritrocitos de la sangre expresado en porcentaje, hematocrito, como indicador de posible anemia (Espinoza y col., 1992).
Figura 2. Detección de A. marginale mediante coloración fluorescente con naranja de acridina Determinación de hematocrito y detección de tripanosomas en capa blanca por Woo.
En la Figura 3 podemos comparar los valores de hematocrito en rebaños bovinos de diferentes localidades y, de allí, tener algún indicativo sobre el estado de la anemia de dichas poblaciones.
Figura 3. Valores promedio de hematocrito (HTO) en bovinos de diferentes fincas. 30 o mayor = valor normal esperado. Entre 25-29 = posible anemia incipiente y menor 25 = anemia
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Diagnóstico inmunológico bovino
En esencia se trata de una metodología indirecta que determina, no la presencia del hematozoario, sino de los posibles anticuerpos tipo IgG o IgM producidos en el bovino a consecuencia de la entrada del patógeno que actúa como inmunógeno (antígeno) para inducir una respuesta inmunitaria. Dado que generalmente se detectan los anticuerpos en el suero sanguíneo, estas metodologías reciben el nombre genérico de serología. Es importante acotar que la presencia de anticuerpos per se no necesariamente se debe tomar como sinónimo de protección. Variados métodos se utilizan en Venezuela como ensayos serológicos o inmunológicos, desde los más clásicos pero menos sensibles como los basados en aglutinación en tubos capilares (Aso y col., 1988), pasando por ensayos mucho más sensibles como la inmunofluorescencia indirecta (Schroeder y col., 1971; Espinoza, 1990; Toro Benítez, 1990, Espinoza y col., 1999a) o el conocido por sus iniciales en inglés ELISA (Enzime Linked ImmunoSorbent Assay), el más usado mundialmente. (Espinoza y col., 1999-b) (Figura 4).
Dada la multipresencia de anticuerpos en el torrente sanguíneo, el punto medular de los ensayos inmunológicos es su especificidad, es decir que mida ciertamente lo que deseamos medir. Esta especificidad viene determinada por la calidad, pureza, del antígeno a ser utilizado, independientemente del método inmunológico seleccionado, el cual condiciona la sensibilidad de la prueba. En nuestro país los diversos centros de investigación disponen de ensayos con mezclas antigénicas crudas, es decir homogenados de eritrocitos infectados (anaplasmas), como es el caso del antígeno de aglutinación capilar o de parásitos purificados (tripanosomas) como se usa en los ELISA para la detección en bovinos (T. vivax) o caballos (T. evansi) infectados con estos flagelados.
En cualquiera de estas mezclas, la molécula antigénica de interés, y valor diagnóstico, viene acompañada de otras decenas de moléculas propias del microorganismo o de la célula dentro de la cual vive. Inmunológicamente hablando estas moléculas son consideradas “impurezas” del preparado antigénico. Aunque esta situación tiende a disminuir la especificidad del ensayo, no lo invalida puesto que el ensayo se basa en la exquisita especificidad de la molécula del anticuerpo para reconocer “su” antígeno. En los ensayos de inmunofluorescencia lo recomendado y que utilizan los diversos laboratorios, es la manufactura de frotis de sangre total de un animal infectado con valores de infección (parasitemias o rickettsemias) razonablemente altos generados en condiciones de laboratorio, tal que permitan la visualización de microorganismo fluorescente producto de su reconocimiento por los anticuerpos de animal en evaluación y el subsecuente añadido de un anticuerpo secundario fluorescente (conjugado).
Los ensayos basados en inmunofluorescencia requieren de microscopios que permitan detectarla, los cuales son equipos de alta inversión pero, una vez adquiridos, su uso es de múltiple aplicación. En la actualidad varias de nuestras universidades y centros de investigación disponen de estos equipos que permiten diagnosticar o evaluar serológicamente anaplasmas, babesias y tripanosomas en bovinos, ovinos, caprinos, equinos, caninos, felinos e incluso en chigüires y venados.
Figura 4. Inmunodiagnóstico 1. Ensayo de aglutinación capilar 2. Inmunofluorescencia tripanosoma 3. Placa de un ELISA mostrando pozos positivos (color) y negativos 4. Niveles de anticuerpos anti tripanosoma medidos mediante ELISA (D.O. 0.405) en bovinos de cuatro fincas distintas. Línea roja = punto de corte.
La búsqueda de mejores y más puros antígenos de hemoparásitos para lograr inmunoensayos con mayor especificidad es una tarea constante de diversos centros de investigación en el mundo y también en Venezuela, especialmente para ser utilizados en la técnica de ELISA por su alta sensibilidad. Así por ejemplo investigadores venezolanos han logrado mediante refinadas técnicas bioquímicas purificar una proteína de la superficie del T. evansi que tiene reacción cruzada con el T. vivax optimizando un ELISA para el inmunodiagnóstico de la tripanosomosis bovina (Uzcanga y col., 2002).
Gracias al advenimiento de las técnicas del ADN recombinante se puede introducir en el genoma de bacterias como E. coli, fragmentos del ADN de un hemoparásito que codifique para una proteína antigénica. De esta forma, la maquinaria metabólica de la bacteria sintetiza en forma continua la proteína de interés y se denomina recombinante, generando muchas copias de la molécula que se usa como antígeno.
Este es el caso de la proteína mayor de superficie número 5 (MSP5) de A. marginale cuyo gen se introduce en el genoma bacteriano y se obtiene la MSP5 recombinante para su uso en el diagnóstico serológico de la anaplasmosis bovina en Venezuela (Reyna-Bello y col., 1998; Eleizalde y col., 2007).
La misma estrategia de la técnica de ADN recombinante se ha utilizado para que bacterias produzcan un fragmento de la proteína denominada BiP/HSP 70 de T. vivax y se pruebe como antígeno para ELISA en el diagnóstico de la tripanosomosis bovina (Rojas, 2010). Otra técnica novedosa para la producción de antígenos para el inmunodiagnóstico por ELISA es la obtención de péptidos sintéticos. Éstos son secuencias sintéticas de 15 a 20 aminoácidos de una proteína preseleccionada de un hemoparásito que puede ser reconocida como sitio de unión (epítope) por los anticuerpos que se generan en la respuesta inmunitaria de un bovino a un patógeno, por ejemplo Babesia bovis (Bremo, 2012).
Es importante resaltar que un resultado serológico positivo, independientemente de la prueba seleccionada, lo que está indicando es la presencia de anticuerpos en el suero contra el hemoparásito evaluado y no necesariamente indica la presencia de patógeno en el momento de la toma de la muestra. Este tipo de ensayos son muy convenientes para las evaluaciones epidemiológicas de las enfermedades por hemoparásitos en rebaños o localidades particulares pues detecta tanto animales actualmente infectados o que hayan eliminado el microorganismo bien por el sistema inmune del bovino o por tratamientos con drogas especificas.
Diagnóstico molecular bovino
Este tipo de diagnóstico es el más novedoso y se basa en la detección de fragmentos de ADN del hemoparásito de interés utilizando sondas de ADN muy específicas, cebadores, según el microorganismo a identificar. La técnica utilizada es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) que permite obtener un gran número de copias de un fragmento de ácido nucleico en particular, denominado amplicón. Para ello se requiere usar una enzima, la ADN polimerasa, que replica las hebras del ADN en varios ciclos de altas y bajas temperaturas. Luego los productos de PCR pueden ser visualizados directamente en un gel de agarosa con algún colorante especifico para ADN como el bromuro de etidio o el SyberSafe® (Tavares- Marques y Reyna-Bello, 2006; Fernández, 2009; Añez-Rojas, 2010). El primer paso es extraer el ADN de la muestra de sangre del bovino por técnicas convencionales.
En este ADN extraído tendremos mezclados el ADN propio del bovino, proveniente principalmente de sus glóbulos blancos, y en muy pequeña proporción el ADN del o los patógenos que estén infectando al animal. Un aspecto a cuidar es la calidad del ADN extraído lo cual se evidencia sometiendo el ADN a un campo eléctrico, electroforesis, en un soporte semisólido como es el gel de agarosa y, después de un corto tiempo de esta corrida electroforética, el gel se colorea con un reactivo especifico para ácidos nucleícos que permite visualizar las bandas del ADN extraído (Figura 5). Seguidamente se procede a realizar la PCR para generar múltiples copias de un fragmento particular de ADN del patógeno de interés, si está presente, usando sondas (cebadores) especificas según sea A. marginale, Babesia sp o T. vivax.
Figura 5. Bandas de ADN extraídas de sangre bovina mostradas mediante electroforesis en gel de agarosa teñidas con Syber Safe ®.
Esta PCR se realiza en un aparato denominado termociclador el cual se programa para generar ciclos de gradientes de temperaturas apropiados para cada cebador. Los productos de la amplificación de estos fragmentos específicos de ADN del microorganismo, amplicones, pueden visualizarse mediante la electroforesis en geles de agarosa. Así por ejemplo, la Figura 6 representa un sistema control de referencia que muestra tres distintos geles de agarosa con los amplicones obtenidos de las PCR a partir de ADN de cada uno de los hemoparásitos indicados usando los cebadores específicos que se señalan. Los amplicones de los distintos patógenos se pueden distinguir según su tamaño molecular que dependen del número de pares de bases (pb) que contengan. En esta figura se aprecia que el amplicón de T. evansi (480 pb) es de mayor tamaño que el amplicón del T. vivax (250 bp), lo cual permite distinguir si un animal está infectado con uno u otro tripanosoma, o con ambos.
Figura 6. Productos de PCR controles visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa teñidos con Syber Safe®. [A] Anaplasma marginale: Proteína mayor de superficie 5 (MSP5) Amplicón 714 pb [B] Babesia sp: Región 18S mitocondrial. PiroA/B, amplicón [C] Trypanosoma: Espaciadores transcritos internos (ITS), región 18S mitocondrial, Amplicón T. vivax 250 pb, Amplicón T. evansi 480 pb.
En la práctica, las Figuras 7 y 8 muestran los resultados de PCR de muestras de sangre de bovinos a campo analizados por esta técnica para detectar la presencia de A. marginale (Figura 7) y Trypanosoma sp (Figura 8). En la Figura 7 se observa que los animales 63, 64, 65, 66, 69, 70, 71 72 y 73 presentan amplicones iguales al de A. marginale (C+), indicando que son positivos a esta rickettsia.
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa para visualizar los resultados de las muestras amplificadaspor PCR utilizando cebadores MSP5 de A. marginale correspondientes a bovinos de un rebaño. C+: A. marginale
Por el contrario todas las muestras analizadas en la Figura 8 son negativos por PCR a especies de Trypanosoma pues no presentan amplicones equivalentes a los controles de T. evansi o de T. vivax.
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa para visualizar los resultados de las muestras (A-N) amplificadas por PCR utilizando cebadores ITS1 correspondientes a bovinos de un rebaño. Controles para T. evansi (480 bp) y T. vivax (250 bp)
Este ensayo molecular complementa los dos anteriormente descritos y, junto con la sintomatología clínica, dan un excelente cuadro de la problemática por hemoparásitos de un animal o de un rebaño permitiendo al médico veterinario tomar decisiones más acertadas para un tratamiento, médico y económico, más racional (Figura 9).
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Retos y perspectivas
Nuestra realidad es que este reporte refleja solo una muy pequeña parte de los estudios y avances que sobre el diagnóstico de hemoparásitos se realizan en nuestras universidades y centros de investigación con el cofinanciamiento del FONACIT y otras instituciones. Significativos aportes en este tema se han hecho también en relación a los hemoparásitos que infectan equinos, caninos y felinos. En este sentido un primer reto es la divulgación de estas nutridas y crecientes investigaciones en nuestro país y, Medicina Veterinaria al día es un muy buen instrumento para ello. De igual manera, la Red de Hemoparásitos con su pagina web (www.redhemoparasitos. grupos.usb.ve) intenta poner al alcance de investigadores, veterinarios, productores y estudiantes de las diversas carreras universitarias, la información relacionada con el tema de las hemoparasitosis en Venezuela.
Un segundo reto a lograr es el compromiso que más jóvenes universitarios de las carreras de veterinaria, agronomía, producción animal, zootecnia, biología, bioanálisis y otras afines se interesen por el fascinante mundo de las hemoparasitosis de interés veterinario, su diagnóstico, su distribución, su epidemiología, sus vectores y sus consecuencias para la salud animal y humana, así como su impacto en la producción alimentaria y en la economía agropecuaria. Por último, pero no menos importante, es el reto que las universidades logren convertir y transferir toda esta generación de conocimientos en servicios rigurosos, eficientes, eficaces y oportunos al productor nacional. Logros concretos en este sentido los tenemos en los laboratorios de diagnóstico de la Universidad del Zulia y en la Universidad Francisco de Miranda. Ellos son un buen ejemplo de esta imperiosa necesidad para construir sobre lo construido.
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Bibliografia
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